超分辨率顯微鏡技術(shù)徹底改變了生物學(xué)，因為在過去十年。 在他們的幫助細胞組分現(xiàn)在可以在蛋白質(zhì)的大小可視化。 然而，成像活細胞是對于大多數(shù)的超分辨率的原則是一個挑戰(zhàn)。 在這方面，一個名為uPAINT（通用積分累積成像納米級地形）技術(shù)抓住了關(guān)注。 此單分子方法利用連續(xù)標(biāo)記，任意生物分子膜的動態(tài)成像在活細胞中以非常高的密度以顯示超分辨的圖像和單個分子的軌跡。 定位顯微鏡 例如STORM，dSTORM / GSDIM或（SPT）的PALM基于本地化超分辨率技術(shù)基于時間去相關(guān)的熒光。 通過實現(xiàn)分離的分子“發(fā)射，隨后將其定位與subdiffraction精度可以用來重建超分辨的圖像。 為了使這些方法來工作，視場內(nèi)的分子的絕大多數(shù)必須處于非發(fā)光狀態(tài)。 為了實現(xiàn)熒光發(fā)射的時間分離，制定了幾種方法： STORM（隨機光學(xué)重建顯微鏡）方法，通過將大多數(shù)人口的進入一個黑暗的狀態(tài)，具有高功率激光照明的幫助下實現(xiàn)單分子的時間分辨熒光.為了使這種方法的工作樣品必須被嵌入在氧化或還原緩沖劑以穩(wěn)定的熒光團的斷開狀態(tài)。 隨機的分子的一個亞群逸出從暗狀態(tài)和發(fā)出熒光。 這種“對速度”可以是微調(diào)由圍繞標(biāo)本和照明與第二激光（405納米）的解決方案，它減少了在關(guān)閉狀態(tài)的壽命。 PALM（圖片激活定位顯微鏡）技術(shù)采用光活化/敞篷熒光蛋白，可以“變身”開和關(guān)。激活后，他們進行成像，直到他們漂白。 在這種情況下，激活光源的強度決定了熒光激活率。 用定位顯微鏡技術(shù)的幫助下，一個子衍射分辨率達到和細胞組分可在前所未有的細節(jié)進行可視化。 然而存在用于這些類型的方法實現(xiàn)，即天然蛋白質(zhì)的超分辨圖像上活細胞的一個重大挑戰(zhàn)。 當(dāng)研究人員要求，研究內(nèi)源性蛋白在高密度在活細胞中，無論是STORM 也PALM技術(shù)完美地完成所有必需的前提條件。在基于STORM的情況下，接近降低成像緩沖區(qū)與活細胞不兼容。 PALM又取決于遺傳修飾的嵌合光活化的熒光蛋白質(zhì)的利用率，從而內(nèi)源性蛋白不能被觀察到。 通用積累點成像的納米地形（uPAINT）是一個復(fù)雜的技術(shù)規(guī)避這些問題。它的工作原理是動態(tài)成像單分子軌道上下偏斜照明細胞表面，因此導(dǎo)致在超分辨的天然生物分子的行為的跟蹤，在活細胞的表面上。 相比之下，傳統(tǒng)的定位顯微鏡方法，其利用用于成像的分子的一小部分隨機的熒光發(fā)射，uPAINT由成像低濃度的熒光配體，因為它們結(jié)合，并與它們的靶相互作用的小光量內(nèi)實現(xiàn)熒光信號的時間分離。 該uPAINT原則 通用PAINT追溯到原來的做法稱為漆 （點積累的成像納米拓樸圖）。用于此目的的熒光標(biāo)記的探針擴散在溶液中，并開始在結(jié)合到感興趣的對象，以發(fā)出熒光。阿列克謝Sharanov和Robin Hochstrasser通過連續(xù)靶向脂質(zhì)雙層和大單層囊泡與尼羅紅是不發(fā)熒光的水溶液而開始發(fā)熒光在疏水環(huán)境中引入這種方法。在水中快速分子擴散導(dǎo)致尼羅紅的恒定通量在膜的附近。隨后出現(xiàn)從它進入膜的時刻的熒光信號。在這種新的環(huán)境探測成為熒光和流動性急劇下降，使得其檢測帶攝像頭（幾毫秒），直到光漂白發(fā)生。 通過確定每個單獨的熒光信號，大約分辨率的心25（nm）是可能的。 然而，由于非常短的持續(xù)時間插入（毫秒）就不可能追蹤單個分子在長時間內(nèi)的行為。（奧林巴斯顯微鏡） 后來格雷戈里Giannone和Eric Hosy重點，克服一些原漆技術(shù)的局限性。 通過使用特定的熒光配體（即抗體）代替非特異性膜染料，單，特定蛋白質(zhì)相互作用的動態(tài)成像成為可能。由于更廣泛的應(yīng)用帶寬，這種方法被命名為通用PAINT。 對于這種技術(shù)背景未結(jié)合標(biāo)記的配體存在于培養(yǎng)基中的熒光，通過使用斜光 （圖1）克服。從轉(zhuǎn)移其預(yù)期使用TIRF激光是關(guān)鍵。發(fā)送激光略低于臨界角向載玻片導(dǎo)致了“ 高度傾斜和層壓光學(xué)片 ”（HILO）傾斜穿過試樣的形成。 本卷中只有熒光很興奮。 低濃度的標(biāo)記的配體加入到介質(zhì)洗澡的檢體內(nèi)部的緩沖器。布朗擴散導(dǎo)致配體在細胞表面的連續(xù)和隨機結(jié)合到它們的目標(biāo)。希洛光路內(nèi)只熒光很興奮和成像（圖1）。